El Servicio de Interacciones Moleculares se encarga del estudio cuantitativo (tamaño, masa molecular, estado de asociación/estequiometría y afinidad) de macromoléculas y complejos macromoleculares en disolución, además de prestar asesoramiento y apoyo al usuario en la ejecución de técnicas biofísicas de dispersión de luz dinámica (DLS) y estática multiángulo (SEC-MALS),  interferometría de biocapa (BLI), medidas de intensidad y anisotropía de fluorescencia y espectroscopía de correlación de fluorescencia.

En 2009 el laboratorio consiguió la certificación conforme a la norma ISO9001 con el código ER-0286/2009.

SERVICIOS OFERTADOS

Ultracentrifugación Analítica (AUC): Determinación del tamaño, grado de homogeneidad, proporción de especies, estequiometría, reversibilidad y afinidad de proteínas y otras macromoléculas biológicas en disolución por Velocidad y Equilibrio de Sedimentación.

Dispersión de Luz Dinámica (DLS): Determinación del grado de polidispersidad de la muestra, coeficiente de difusión traslacional de macromoléculas y cálculo de su radio hidrodinámico.

Cromatografía de Exclusión Molecular acoplada a Dispersión de Luz Estática Multiángulo (SEC-MALS): Separación de las diferentes especies presentes en disolución en una muestra y determinación de su masa molecular.

Interferometría de Biocapa (BLI): Determinación de la afinidad y tasas de asociación y disociación en interacciones entre proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, pequeños ligandos y lípidos, en tiempo real.

Espectroscopia de Correlación de Fluorescencia (FCS): Estudio de la polimerización y agregación de proteínas, así como la detección y medida de interacciones moleculares que generan complejos. El Servicio proporciona asistencia para su uso y la limpieza y funcionalización (silanizado y pegilado) de superficies de vidrio para evitar la adsorción inespecífica de proteínas durante el desarrollo de los experimentos de FCS.

Medidas de Intensidad y Anisotropía/Polarización de Fluorescencia: Detección y cuantificación de interacciones moleculares en el rango picomolar, incluyendo aquellas en las que participan proteínas, ácidos nucleicos, péptidos y ligandos.

Para más información contactar con:

 

EQUIPOS DEL SERVICIO

  • Ultracentrifugación Analítica (AUC): dos ultracentrífugas analíticas Beckman-Coulter, una Optima XLA equipada con un sistema de detección de absorción UV-VIS y una Optima XLI con dos sistemas de detección integrados, UV-VIS de longitud de onda variable e interferencia de Raleigh.
  • Dispersión de Luz Dinámica (DLS): equipo modelo DynaPro MS/X de Wyatt Inc.
  • Cromatografía de Exclusión Molecular acoplada a Dispersión de Luz Estática Multiángulo (SEC-MALS): equipo multiángulo modelo DAWN-EOS, de Wyatt Inc., con detector de índice de refracción modelo Optilab rEX, de Wyatt Inc.
  • Interferometría de Biocapa (BLI): interferómetro de biocapa ForteBioBLItzTM
  • Espectroscopía de Correlación de Fluorescencia (FCS): microscopio confocal de fluorescencia resuelta en el tiempo, MicroTime 200 (PicoQuant), con sensibilidad de una sola molécula, excitación mediante dos láseres pulsados de picosegundos (481 + 635) nm, PicoHarp 300, escaneado 3D y cuatro canales de detección (con dos MPD y dos AQR-SPAD)
  • Intensidad y Anisotropía/Polarización de Fluorescencia: lector de placas Spark® Multimode (Tecan) equipado con polarizadores para medir anisotropía y con filtros para la selección de longitudes de onda [Ex: 360 (35), 485 (20), 530 (25), 560 (20), 620 (20). Em: 340 (20), 465 (35), 535 (25), 595 (35), 620 (20), 680 (30)].
 

Instrucciones

Para solicitar cita o información sobre cualquiera de las técnicas ofrecidas se debe contactar previamente con el Servicio a través de su correo electrónico (uanalitica@cib.csic.es) o el teléfono 91 837 3112 Ext. 442697.

Tarifas (click aquí)

Las tarifas incluyen, según corresponda:

  • El diseño experimental en los experimentos de Ultracentrifugación Analítica.
  • La adquisición de los datos.
  • Ensamblaje, desmontado y limpieza de celdas de ultracentrifugación.
  • Suministro de archivos con datos en crudo
  • Informe detallando la calidad de la muestra (heterogeneidad, grado de asociación, etc.), coeficiente de sedimentación y masa molecular promedio (sólo en el método de equilibrio de sedimentación).

El análisis en detalle, la interpretación de los resultados y la preparación de figuras y texto para su publicación no están incluidas en el servicio, sino que, en caso necesario, pueden incluirse en la categoría de “colaboración” cuyas condiciones serán negociadas por adelantado entre el investigador principal del grupo usuario y el personal del Servicio.

Para experimentos de Ultracentrifugación Analítica los usuarios pueden consultar aquí los requisitos que deben cumplir las muestras.

     

    Miembros

     

    Más Información

    La Ultracentrifugación Analítica consiste en un conjunto de métodos (velocidad y equilibrio de sedimentación) que permiten la determinación del tamaño, la forma global aproximada, y el grado de homogeneidad de proteínas y otras macromoléculas biológicas en disolución. Estos métodos están especialmente adaptados para la detección y la caracterización cuantitativa de las interacciones (proporción de especies, estequiometría, reversibilidad y afinidad) que dan lugar a la formación de complejos macromoleculares, incluyendo las interacciones proteína-proteína, DNA-proteína y receptor-ligando [Howlett et al. (2006) Curr. Opin. Chem. Biol. 10:430-436; Lebowitz et al. (2002) Protein Sci. 11:2067-2079; Minton (2000) Exp. Mol. Med. 32:1-5; Rivas et al. (1999) Methods 19:194-212].

    XLA & XLIVSSV Peaks

    Desde su creación en 1994, esta Unidad del CIB ha dado apoyo científico-técnico en la caracterización biofísica de proteínas y sus interacciones a un gran número de grupos de investigación del CSIC, universidades, empresas, así como a otros centros de investigación nacionales y extranjeros. La Unidad cuenta con el asesoramiento y la colaboración de grandes expertos internacionales en estas metodologías y ha participado en más de 300 publicaciones desde su fundación.

    La Dispersión de Luz Dinámica proporciona información rápida y complementaria a la obtenida mediante ultracentrifugación analítica, aportando dos grandes ventajas frente a otros métodos analíticos: el bajo volumen de muestra requerido (15-45 µl) y la rapidez en la obtención de los resultados (<10 min). La técnica permite conocer el grado de polidispersidad de una muestra, determinar el coeficiente de difusión traslacional de las especies macromoleculares en disolución y calcular su radio hidrodinámico. Este equipo (modelo DynaPro MS/X, Wyatt Inc.) tiene un manejo muy sencillo (cubeta) con un sistema de regulación de la temperatura por Peltier (4-60ºC) y se puede utilizar para el análisis de diferentes tipos de macromoléculas como proteínas, polisacáridos, nanopartículas y micelas lipídicas. 

    DLSDLS Plot

    La Cromatografía de Exclusión Molecular Acoplada a Dispersión de Luz Estática Multiángulo (modelo DAWN-EOS, Wyatt Inc.) separa las diferentes especies presentes en la muestra en función de su tamaño y mide simultáneamente su concentración (modelo Optilab rEX, Wyatt Inc.) y la intensidad de la luz dispersada, de manera que permite la obtención de su masa molecular.

    También se puede utilizar para el estudio de interacciones macromoleculares en disolución mediante la formación de un gradiente de concentraciones (método CG-MALS) [ver Attri & Minton (2005) Anal. Biochem. 337:103-110]. En este último caso se utiliza una bomba programable de triple jeringa (modelo CALYPSO, Wyatt Inc.) para la inyección secuencial de concentraciones variables de proteína/s y tampón. La información sobre la interacción se obtiene en pocos minutos (importante cuando la estabilidad del sistema es un factor a considerar).

    • En esta Unidad se han realizado diferentes estudios sobre los procesos de oligomerización y polimerización de proteínas, mediante el uso combinado de las técnicas de ultracentrifugación y dispersión de luz (Monterroso et al. (2013) Methods 59: 349–362; del Castillo et al. (2011) Biochemistry, 50: 1991–2003).

    MALS

    La Interferometría de Biocapa (BLI) es una técnica óptica rápida y sencilla para estudiar las interacciones entre proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, pequeños ligandos y lípidos, en tiempo real, empleando volúmenes de muestra muy pequeños (4,5 µL). La técnica proporciona información sobre afinidades de unión y tasas de asociación y disociación entre una molécula, inmovilizada en un biosensor de fibra óptica y un analito en solución. Las bajas concentraciones de muestra empleadas (nM) la hacen especialmente interesante para proteínas de difícil purificación, con la ventaja de poder estudiar las interacciones incluso en lisados heterogéneos, dado que el patrón de interferencia no se ve afectado por los cambios en el índice de refracción del medio.         

    BLItzSensogram

     

    La espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) permite evaluar las fluctuaciones temporales de la intensidad de fluorescencia para obtener información sobre la movilidad de las moléculas, que está relacionada con su tamaño y forma. De esta manera, se puede estudiar la polimerización y agregación de proteínas. FCS también es una poderosa herramienta para la detección y medida de interacciones moleculares que generan complejos sustancialmente más grandes que las especies libres. La técnica de FCS constituye un complemento ideal para otras metodologías disponibles en el Servicio, como la ultracentrifugación analítica y la dispersión de luz (Monterroso et al. (2013) Methods 59: 349–362).

    fcs plot

    FCS microscopio

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    Las medidas de intensidad y anisotropía/polarización de fluorescencia permiten la detección y cuantificación de interacciones moleculares, incluyendo aquellas en las que participan proteínas, ácidos nucleicos, péptidos y ligandos, con alta sensibilidad y bajo consumo de muestra. La anisotropía es especialmente adecuada para este propósito, dado que depende del volumen molecular y, por lo tanto, es sensible a cambios de tamaño que tienen lugar al formarse los complejos.  La alta sensibilidad de estas medidas (picomolar), posibilita la evaluación de interacciones de alta afinidad en condiciones de equilibrio. Utilizando lectores de placas, las medidas pueden realizarse rápida y simultáneamente en cientos de muestras de bajo volumen (unos pocos microlitros), lo que abre la puerta al desarrollo de ensayos sistemáticos de interés en biotecnología y biomedicina.

    Lector de placas Spark

    Grupos de Investigación y Usuarios del Servicio.

    Publicaciones.

    Encuestas de satisfacción 2023.