Descripción
Los plásmidos bacterianos son un sistema modelo útil para el análisis bioquímico, biofísico y estructural de las interacciones proteína-proteína, proteína-DNA y RNA-RNA, que constituyen la base molecular de procesos esenciales tales como la replicación del DNA y la expresión génica, así como su regulación. En nuestro grupo de investigación llevamos muchos años estudiando la replicación del plásmido estreptococal promiscuo pMV158 y su control, el cual se efectúa por represión transcripcional e inhibición traduccional del gen que codifica la proteína iniciadora del proceso replicativo. Estos estudios han puesto de manifiesto la singularidad del replicón de pMV158 respecto a otros plásmidos con replicación por “círculo rodante” en múltiples aspectos, algunos de los cuales pueden subyacer a la enorme promiscuidad de este plásmido. Se han analizado los siguientes elementos del replicón básico de pMV158:
- RepB continúa siendo el único iniciador Rep plasmídico de la superfamilia de endonucleasas HUH con estructura atómica resuelta. Su conformación hexamérica es singular entre las Rep codificadas por plásmidos con replicación por “círculo rodante”. Cada protómero de RepB consta de un dominio N-terminal (el denominado Origin Binding Domain, OBD), que contiene tanto las actividades catalíticas como la capacidad de reconocimiento específico del origen plasmídico, que está unido mediante una corta región bisagra al dominio de oligomerización (OD), el cual está a su vez involucrado en la hexamerización de la proteína. La enorme flexibilidad de la región bisagra permite que los OBDs adopten una gran variedad de orientaciones relativas al rígido andamiaje cilíndrico formado por los ODs. Mediante la construcción y caracterización de mutantes proteicos estamos estudiando las bases moleculares que subyacen en: i) el reconocimiento específico del DNA del origen por RepB; ii) la actividad catalítica de RepB en las etapas de iniciación y terminación de la replicación; y iii) la posible participación de RepB en el desenrollamiento del DNA. Este último estudio conllevará asimismo el uso de una serie de mutantes que hemos construido en la helicasa PcrA del huésped. El modelo derivado de estos análisis podría ayudar a explicar la gran promiscuidad de pMV158.
- CopG es uno de los elementos de control de la replicación de pMV158, y actúa reprimiendo la transcripción del operón copG-repB. CopG es el represor transcripcional más pequeño que se ha caracterizado. La alta afinidad y especificidad de CopG por su DNA diana se basan en la unión secuencial y cooperativa de dímeros de CopG a los 4 sub-sitios que constituyen su operador. En ausencia de interacciones cooperativas, CopG sólo se une al sitio primario del operador. Mediante “footprinting” de alta resolución hemos determinado el orden secuencial de unión de CopG al operador. El modo de unión de CopG al DNA, único entre las proteínas de la superfamilia RHH, arroja luz sobre el mecanismo usado por este represor transcripcional para desalojar a la RNA polimerasa establemente unida al promotor. Además de su papel en el control de la replicación en estado de equilibrio de pMV158, CopG tiene un papel clave durante el establecimiento del plásmido en un nuevo huésped, ya que la actividad desreprimida del promotor regulado por CopG is crucial para la exitosa colonización por el plásmido de las células bacterianas huéspedes. Así, CopG podría usarse como un factor de inmunidad para prevenir la "infección" de una posible bacteria huésped con el plásmido donador diana. Estos hallazgos pueden extrapolarse a otras proteínas que reprimen la transcripción de los genes rep de plásmidos que replican ya sea mediante círculo rodante o por un mecanismo tipo "theta".
- RNAII es el otro elemento implicado en el control de la replicación de pMV158. Se trata de un pequeño “antisense” RNA codificado en cis, complementario a la región del mRNA copG-repB que se encuentra inmediatamente a 5’ de las señales de iniciación de la traducción de repB. Al contrario de lo que ocurre en la mayoría de los sistemas de control de la replicación plasmídica por “antisense” RNA, la interacción entre RNAII y su diana en el mRNA copG-repB no requiere la formación de un “kissing complex”, sino que necesita la región 3’ de la cola monocatenaria 5’ terminal del RNAII. Por su parte, la capacidad inhibidora de RNAII recae en la región 5’ de dicha cola 5’ terminal. Las características de RNAII le hacen potencialmente útil para la construcción de vectores para silenciamiento génico en bacterias Gram-positivas.
Además, la caracterización del replicón de pMV158 nos ha permitido definir una familia cada vez más numerosa de plásmidos aislados de una gran variedad de bacterias (mayoritariamente del filo Firmicutes, muchas de ellas BAL). Nuestro grupo ha usado algunos de estos replicones para construir vectores para la clonación y expresión de genes, para la caracterización de promotores y regiones reguladoras, así como para el marcaje fluorescente de bacterias.
Aprovechando la experiencia de nuestro grupo en el análisis de la replicación plasmídica y la regulación de la expresión génica, nos proponemos caracterizar el replicón y la expresión del gen que codifica la dextransacarasa del plásmido pMN1, aislado de Lactobacillus sakei y responsable de la producción de dextrano por la bacteria hospedadora. Igualmente, en el marco de una colaboración con el Prof. Jesús Murillo (Universidad Pública de Navarra, Pamplona), hemos contribuido a la caracterización preliminar de un segundo replicón del plásmido de virulencia pPsv48C de Pseudomonas syringae, que parece consistir en una quimera natural entre el gen que codifica una nueva proteína de replicación y una posible región de control de la replicación presente en la familia PFP de plásmidos de virulencia ampliamente distribuida.
Referencias:
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