Descripción
Las proteínas autoflorescentes no requieren sustrato para mostrar su actividad. Por este motivo permiten la detección in vivo y en tiempo real de las bacterias portadoras. Existen numerosos vectores plasmídicos que codifican las proteínas fluorescentes de forma funcional en Escherichia coli.
Sin embargo, existen muy pocas herramientas genéticas de este tipo que sean eficientemente funcionales en bacterias Gram-positivas con excepción de Bacillus subtilis. Por ello, nuestro grupo de investigación, gracias a su experiencia en replicación y en mecanismos de regulación de expresión génica, ha desarrollado y continúa optimizando diversos vectores plasmídicos que permiten: i) la expresión de genes, ii) la detección y cuantificación de expresión génica en bacterias Gram-positivas, y iii) el marcaje de células bacterianas en modelos in vitro (interacciones bacteria-líneas celulares eucarióticas) e in vivo (colonización bacteriana del tracto digestivo de Dario renio (pez cebra) y ratones).
Estos vectores son funcionales, entre otras bacterias, en Lactococcus lactis, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Pediococcus parvulus, así como en especies pertenecientes a los géneros Lactobacillus, Leuconostoc y Enterococcus, y están siendo comercializados por la empresa Solmeglas (https://solmeglas.com/categoria-producto/biologia-molecular). Los vectores codifican versiones de las proteínas fluorescentes: verde (GFP) de Aqueora Victoria, y roja (versión monomérica, mCherry) de Dicosoma sp., cuyos genes codificantes están optimizados para su expresión en bacterias. Además, los espectros de excitación y emisión de la GFP y la mCherry permiten la detección simultánea de ambas proteínas.
Entre otros vectores, en colaboración con los grupos de la Dra. Teresa Requena, del Instituto de Investigación en Ciencias de la Alimentación (CIAL, CSIC, Madrid), y del Prof. Jerry Wells, de la Universidad de Wageningen (Holanda), hemos desarrollado dos familias de vectores de expresión de la mCherry, funcionales tanto en bacterias Gram-positivas incluyendo bacterias lácteas (BAL) como en Escherichia coli debido a la existencia de dos replicones o a la de un replicón promiscuo perteneciente a la familia del plásmido pMV158. Estos vectores permiten la evaluación de secuencias promotoras uni- y bi-direccionales y están siendo utilizados actualmente para evaluar la expresión de genes de BAL tanto en el hospedador natural como en bacterias heterólogas. Además, hemos construido un vector basado en el replicón de pMV158 para la clonación y expresión génica inducible por maltosa. También, los vectores antedichos han permitido el desarrollo de plásmidos para el marcaje fluorescente de las bacterias portadoras, ya sea mediante la clonación de un promotor funcional que dirija la expresión del gen mrfp, que codifica la proteína mCherry o mediante la clonación del gen gfp bajo el control del promotor regulado por maltosa. Así, hemos validado la actividad de promotores de cepas pertenecientes a los géneros Lactobacillus, Leuconostoc y Pediococcus . Además, han sido utilizados para expresar en forma activa en Leuconostoc mesenteroides, la dextran sacarasa de Leuconostoc lactis, ampliando el espectro de BAL para el análisis de expresión génica y producción de enzimas de interés industrial.
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