Descripción
El trabajo realizado en nuestro grupo durante los últimos años ha revelado que Escherichia coli constituye un sistema modelo ideal para el estudio de las rutas bioquímicas y los mecanismos moleculares que controlan la expresión de los genes responsables del catabolismo de ácidos aromáticos que son fuente de carbono frecuente en el medio ambiente. Se han estudiado las relaciones estructura-función de los reguladores transcripcionales que controlan específicamente las rutas de degradación de los ácidos 3- y 4-hidroxifenilacético (represor HpaR), 3-hidroxifenilpropiónico (activador MhpR), y fenilacético (represor PaaX), así como la síntesis de la penicilina G (represor PaaX). La interacción con los correspondientes inductores y promotores regulados también se ha analizado, y ha permitido desvelar aspectos novedosos en el campo de la regulación transcripcional en procariotas. A la regulación específica de cada ruta se superpone otro control que está mediado por reguladores globales de E. coli, tales como las proteínas IHF y CRP, que ajustan la transcripción de los genes catabólicos al estado fisiológico de la célula (fenómenos de represión catabólica, condiciones de stress, etc.), y que también están siendo objeto de estudio en nuestro grupo. Algunos estudios estructurales de los reguladores HpaR, MhpR, y PaaX se están realizando en colaboración con los grupos de cristalografía (Dr. J. Hermoso) y calorimetría (Dra. M. Menéndez) del Instituto de Química-Física Rocasolano del CSIC en Madrid; y con el grupo del Dr. J.M. Sanz de la Universidad Miguel Hernández de Elche. Por lo que respecta a las enzimas implicadas en las rutas degradativas, se han caracterizado dos etapas de la ruta catabólica del ácido fenilacético: i) la catalizada por la fenilacetil-CoA oxigenasa (PaaABCDE), primera hidroxilasa multicomponente di-Fe que se describe capaz de hidroxilar un compuesto aromático derivado de CoA; y ii) la última etapa de la ruta calizada por la b-cetoadipil-CoA tiolasa.
Pseudomonas putida KT2440 es el prototipo de bacteria capaz de catabolizar numerosos compuestos aromáticos y ha sido ampliamente utilizada en el campo de la biotecnología medioambiental. El análisis genómico de esta cepa ha permitido a nuestro grupo la caracterización de su mapa catabólico global frente a compuestos aromáticos. Así, se han identificado los clusters génicos responsables de las rutas centrales de degradación de catecol (cat), protocatecuato (pca) y fenilacetato (paa), así como de las distintas rutas periféricas que convergen en dichas rutas centrales. En colaboración con el grupo del Dr. J. M. Luengo de la Universidad de León se ha caracterizado el cluster hmg implicado en distintos aspectos del catabolismo y regulación transcripcional de la ruta central del homogentisato (la primera que se describe en bacterias) así como los clusters de las rutas periféricas de Phe y Tyr. Además, se han identificado y caracterizado dos nuevas rutas centrales cuyos genes no habían sido descritos previamente en bacterias: el cluster gal para la degradación de ácido gálico y el cluster nic para la degradación del ácido nicotínico. La identificación de metabolitos mediante técnicas de RMN se ha realizado en colaboración con el Dr. J. Jiménez-Barbero del Departamento de Ciencia de Proteínas del CIB. Ambas rutas contienen proteínas que definen nuevas familias de enzimas, tales como las dioxigenasas de ruptura del anillo aromático (GalA y NicX), la isomerasa (GalD) e hidratasa (GalB) que participan en la ruta gal, o que son de gran interés biotecnológico, como la monoxigenasa NicAB que transforma el nicotinato a 6-hidroxinicotinato, un importante precursor de insecticidas en la industria farmacéutica. Dentro de un proyecto coordinado por el Dr. F. Rojo del Centro Nacional de Biotecnología-CSIC de Madrid y con la utilización de un DNA-chip genómico de P. putida KT2440 hemos realizado estudios de expresión génica global de la cepa para determinar, por primera vez, el transcriptoma de esta bacteria cuando se cultiva en presencia de distintos compuestos aromáticos o en mezclas de éstos. En colaboración con el grupo del Dr. J. Perera de la Universidad Complutense de Madrid se han caracterizado las dos rutas de degradación de fenilacetato de Pseudomonas sp. Y2, una bacteria capaz de degradar estireno vía ácido fenilacético. El diseño de casetes catabólicas portadoras de los genes sty, responsables de la conversión de estireno a fenilacetato, ha permitido generar distintas cepas de Pseudomonas capaces de combinar el catabolismo del estireno con la degradación de otros compuestos tóxicos tales como mezclas BTEX (benceno, tolueno, etilbenceno y xileno). Además, se ha caracterizado un nuevo circuito regulador de los genes sty y que implica al inductor fenilacetil-CoA y al represor PaaX de la ruta paa.
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